El microscopio TIRF se destaca principalmente por estar conformado por el microscopio invertido NIKON Eclipse T2 y el módulo NIKON H-TIRF. La incorporación de este módulo al microscopio invertido permite implementar la técnica TIRF (Total Internal Reflection Fluorescense) de manera simple, debido a que la alineación del láser está automatizada. Dado que este microscopio incluye además los módulos para la realización de EpiFluorescencia, las imágenes TIRF pueden ser contrastadas con sus correspondientes imágenes de EpiFluorescencia o simplemente con su imagen DIC (Differential contrast microscopy), obtenida a partir de la luz transmitida. El sistema cuenta con distintos láseres y filtros, lo que permite realizar TIRF en muestras marcadas con distintos fluoróforos. Adicionalmente, el microscopio tiene el sistema OptoSplitt II, el cual permite la visualización simultánea de distintos canales, siendo ventajoso en aplicaciones como FURA y FRET. Finalmente, este microscopio incorpora también un módulo para la realización FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).

Microscopio Nikon modelo Eclipse Ti2-E (invertido)
Sistema TIRF motorizado Nikon módulo Ti2-LA-H-TIRF
Sistema EpiFluorescencia Nikon módulo Ti2-LA-FL
Sistema FRAP Nikon módulo Ti2-LA-FRAP
Andor OptoSplit II Incluye cubos para CFP/YFP y TIRF 488/561
Objetivos Plan Apo 20x NA 0.75
Plan Fluor 40x OIL NA 1.30
Apo TIRF 60x DIC OIL NA 1.49
SR HP Apo TIRF 100x OIL NA 1.49
Detección EMCCD Andor iXon 897, tamaño pixel 16 um x 16 um
Software NIS-ELEMENTS AR
Otros Platina motorizada modelo Eclipse Ti-E de Nikon que incluye además el sistema de mantención del foco PFS (Perfect Focus Systems)
Platina de incubación con control de temperatura, humedad y CO2
Fuente de luz Láser estado sólido 405 nm (100 mW)
Láser estado sólido 445 nm (45 mW)
Láser estado sólido 488 nm (100 mW)
Láser estado sólido 514 nm
Láser estado sólido 561 nm (80 mW)
Lámpara de XENÓN LAMBDA DG-4 Plus
Filtros DAPI (Ex 375/28 nm y Em 460/50 nm)
GFP (Ex 488/30 nm y Em 535/40 nm)
Cherry (Ex 540/25 nm y Em 620/60 nm)
Quad (Ex 405/488/561/638 nm y Em 420-480/500-550/580-620/650-750 nm)
Set filtros FRET cubo dual CFP/YFP (Ex 442/514 nm y Em 460-500/530-610 nm)
Set filtros FURA-2 (Ex 340/380 nm y Em 510/80 nm)
  • Medición de concentración de calcio mediante FURA-2.

  • Técnica DIC (Differential interference contrast or Nomarski interference contrast).

  • Tecnica FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).

  • Técnica FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching).

  • Tecnica FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) a alta velocidad.

  • Tecnica TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence).

  • EpiFluorescencia.

Cell spreading

Equipo: Microscopio Nikon TIRF. Técnica: TIRF. Muestra: Linfocitos B de ratón (IIA1.6), transfectados con LifeAct-mCherry (16hrs post transfección). Magnificación 100x.

Autor: Jorge Ibañez, PhD (c), Laboratorio de Comunicación y Función de Células del Sistema Inmune, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile.
Células epiteliales

Equipo: Microscopio Nikon TIRF. Técnica: EpiFluorescencia. Muestra: Cultivo de células epiteliales de la arteria pulmonar de bovino. En rojo están marcadas las Mitocondrias (Mitotracker Red CMXRos), en verde la actina (Alexa fluor 488 - Phalloidin) y en azul el núcleo (DAPI). Magnificación: 60x.

Autor: Fernanda Gárate, UMA-BIO.
Astrocito

Equipo: Microscopio Nikon TIRF. Técnica: EpiFluorescencia. Muestra: Cultivo primario de astrocitos de ratón en inmunofluorescencia indirecta. En la imagen se muestran astrocitos GFAP positivos en rojo (GFAP-555), la presencia de hemicanales de conexina 43, en verde (Cx43 conjugado con Alexa 488) y marca nuclear en azul (Hoechst 33342). Barra de escala = 20um. Magnificación 100x.

Autor: Fernanda Gárate, UMA-BIO.
Diatomea

Equipo: Microscopio Nikon TIRF. Técnica: Diascópica - DIC. Muestra: Diatomeas. Magnificación: 150x.

Autor: Fernanda Gárate, UMA-BIO
Montaje Large Image de Hígado de ratón

Equipo: microscopio Nikon TIRF. Técnica: Large image en campo claro y epifluorescencia. Muestra: corte de hígado de ratón, marcado con tinción histológica hematoxilina-eosina. Descripción de la imagen: la figura muestra un montaje de 4 imágenes adquiridas con el microscopio TIRF empleando el modo Large Image. La imagen superior corresponde a un zoom de la imagen de campo claro. Las dos imágenes inferiores fueron adquiridas en epifluorescencia y corresponden al canal verde y rojo. Barra de escala superior = 100 um e inferior = 1 mm. Magnificación 20x.

Autor: Fernanda Gárate, UMA-BIO.